新买的色谱柱如何活化?用过的如何保养?

色谱柱是高效液相色谱仪最主要的部件,被测物质能否被很好的分离和测定,色谱柱的性能起着决定性的作用。因此,在日常工作中,应特别注意色谱柱的正确使用和维修保养,以延长色谱柱的使用寿命。

01 色谱柱的活化

反相色谱柱:使用新的C18柱时,先用甲醇或乙腈冲洗20-30个柱体积,然后用甲醇/乙腈:水(50:50)冲洗10个柱体积,然后再用流动相平衡10-30柱体积。

正相色谱柱:新柱用流动相平衡20-30个柱体积。

离子色谱柱(SAX, SCX):新柱先用100%甲醇或乙腈冲洗20个柱体积,然后转换到流动相平衡。

部分品牌的氨基柱和氰基柱是保存在正相流动相中,用于反相色谱时,先用异丙醇或乙醇冲洗色谱柱50-100个柱体积。

当用HILIC模式时,新柱用50倍柱体积50/50乙腈/水活化平衡,然后再用流动相平衡20个柱体积。

02 色谱柱的日常保存

反相柱:100%甲醇或乙腈保存。

正相柱:异丙醇或正己烷保存。

离子交换柱:100%甲醇,或大于40%的有机相保存。

切忌用缓冲盐保存色谱柱。

03 色谱柱的清洗和再生

反相C18色谱柱

清洗:每天柱子使用完后,立刻冲洗,如果使用缓冲液,必须先用相同比例的有机相/水冲洗20个柱体积,然后再转换到100%有机相冲洗20个柱体积。

再生:用100%水,甲醇,三氯甲烷,甲醇,100%水分别冲洗20个柱体积,在第一次用100%水时,进样5次200 μL二氯亚砜DMSO。

正相色谱柱

清洗:每次清洗都用低流速起步,当检测到柱压稳定在一定水平后再增加流速。先用10柱体积不含其它添加剂的流动相中的弱溶剂,如正己烷、氯仿等反冲色谱柱。再用20柱体积的诸如二氯甲烷或异丙醇等流动相中的强溶剂反冲色谱柱。

再生:用四氢呋喃,甲醇,四氢呋喃,二氯甲烷,正己烷分别冲洗20个柱体积。

离子色谱柱

清洗:用100%水冲洗30个柱体积去除盐,然后用100%甲醇或乙腈冲洗20个柱体积后保存在50%甲醇或乙腈中。

再生:先用高浓度盐的缓冲液清洗(浓度可以是5-10倍,不超过1M),然后再用100%水洗,100%乙腈或甲醇清洗,再用50%乙腈或甲醇保存。

04 色谱柱日常使用保养

使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度)

注意色谱的pH范围,大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-8

避免流动相组成及极性的剧烈变化

使用HPLC级试剂,流动相使用前必须经脱气和过滤处理

如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相,应在实验完毕将柱子冲洗干净并保存在乙腈中

压力升高是需要更换预柱的信号

确认流动相中缓冲盐的溶解性

确认样品在流动相中的溶解性

避免压力的突变

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